Vedelikkromatograafia on peamine meetod iga komponendi ja lisandite sisalduse testimiseks tooraines, vaheainetes, preparaatides ja pakkematerjalides, kuid paljudel ainetel pole standardseid meetodeid, millele tugineda, mistõttu on uute meetodite väljatöötamine vältimatu. Vedelfaasimeetodite väljatöötamisel on kromatograafiakolonn vedelikkromatograafia tuumaks, seega on ülioluline, kuidas valida sobiv kromatograafiakolonn. Selles artiklis selgitab autor, kuidas valida vedelikkromatograafiakolonni kolmest aspektist: üldised ideed, kaalutlused ja rakendusala.
A. Üldised ideed vedelikkromatograafia kolonnide valimiseks
1. Hinnake analüüdi füüsikalisi ja keemilisi omadusi: nt keemiline struktuur, lahustuvus, stabiilsus (nt kas seda on lihtne oksüdeeruda/redutseerida/hüdrolüüsida), happesus ja aluselisus jne, eriti oluline on keemiline struktuur. omadusi määrav tegur, näiteks konjugeeritud rühmal on tugev ultraviolettkiirguse neeldumine ja tugev fluorestsents;
2. Määrake analüüsi eesmärk: kas on vaja suurt eraldatust, suurt kolonni efektiivsust, lühikest analüüsiaega, suurt tundlikkust, kõrge rõhukindlust, pikka kolonni eluiga, madalat kulu jne;
- Valige sobiv kromatograafiakolonn: mõistke kromatograafilise täiteaine koostist, füüsikalisi ja keemilisi omadusi, nagu osakeste suurus, pooride suurus, temperatuuritaluvus, pH-taluvus, analüüdi adsorptsioon jne.
- Vedelikkromatograafia kolonnide valimise kaalutlused
Selles peatükis käsitletakse tegureid, mida tuleb kromatograafiakolonni valimisel arvesse võtta, lähtudes kromatograafiakolonni enda füüsikalistest ja keemilistest omadustest. 2.1 Täitemaatriks
2.1.1 Silikageeli maatriks Enamiku vedelikkromatograafia kolonnide täitemaatriksiks on silikageel. Seda tüüpi täiteainel on kõrge puhtus, madal hind, kõrge mehaaniline tugevus ja rühmi on lihtne modifitseerida (nagu fenüülside, aminoside, tsüanoside jne), kuid pH väärtus ja temperatuurivahemik, mida see talub, on piiratud: Enamiku silikageeli maatrikstäiteainete pH-vahemik on 2 kuni 8, kuid spetsiaalselt modifitseeritud silikageeliga seotud faaside pH vahemik võib ulatuda 1,5 kuni 10-ni ning on ka spetsiaalselt modifitseeritud silikageeliga seotud faase, mis on madala pH juures stabiilsed, nagu Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, mis on stabiilne pH 1 kuni 8 juures; silikageeli maatriksi ülemine temperatuuripiir on tavaliselt 60 ℃ ja mõned kromatograafiakolonnid taluvad kõrge pH juures temperatuuri 40 ℃.
2.1.2 Polümeermaatriks Polümeertäiteained on enamasti polüstüreen-divinüülbenseen või polümetakrülaat. Nende eelisteks on see, et nad taluvad laias pH-vahemikus – neid saab kasutada vahemikus 1 kuni 14 ja nad on vastupidavamad kõrgetele temperatuuridele (võivad ulatuda üle 80 °C). Võrreldes ränidioksiidipõhiste C18 täiteainetega on seda tüüpi täiteainetel tugevam hüdrofoobsus ja makropoorne polümeer on proovide, näiteks valkude eraldamisel väga tõhus. Selle puuduseks on see, et kolonni efektiivsus on madalam ja mehaaniline tugevus nõrgem kui ränidioksiidil põhinevatel täiteainetel. 2.2 Osakeste kuju
Enamik kaasaegseid HPLC täiteaineid on sfäärilised osakesed, kuid mõnikord on need ebakorrapärased osakesed. Sfäärilised osakesed võivad tagada madalama kolonni rõhu, suurema kolonni efektiivsuse, stabiilsuse ja pikema eluea; kõrge viskoossusega liikuvate faaside (nt fosforhape) kasutamisel või kui proovilahus on viskoosne, on ebakorrapäraste osakeste eripind suurem, mis soodustab kahe faasi täielikku toimet ja hind on suhteliselt madal. 2.3 Osakeste suurus
Mida väiksem on osakeste suurus, seda suurem on kolonni efektiivsus ja suurem eraldumine, kuid seda halvem on kõrgsurvekindlus. Kõige sagedamini kasutatav kolonn on 5 μm osakese suurusega kolonn; kui eraldusnõue on suur, saab valida 1,5-3 μm täiteaine, mis aitab lahendada mõne keeruka maatriksi ja mitmekomponendilise proovi eraldusprobleemi. UPLC võib kasutada 1,5 μm täiteaineid; Poolpreparatiivsete või preparatiivsete kolonnide jaoks kasutatakse sageli 10 μm või suurema osakese suurusega täiteaineid. 2.4 Süsinikusisaldus
Süsinikusisaldus viitab seotud faasi osakaalule silikageeli pinnal, mis on seotud eripinna ja sidefaasi katvusega. Kõrge süsinikusisaldus tagab kolonni suure mahutavuse ja kõrge eraldusvõime ning seda kasutatakse sageli keerukate proovide jaoks, mis nõuavad suurt eraldamist, kuid kahe faasi vahelise pika interaktsiooniaja tõttu on analüüsiaeg pikk; madala süsinikusisaldusega kromatograafilistel kolonnidel on lühem analüüsiaeg ja need võivad näidata erinevat selektiivsust ning neid kasutatakse sageli lihtsate proovide jaoks, mis nõuavad kiiret analüüsi, ja proovide jaoks, mis nõuavad kõrget vesifaasi. Üldiselt jääb C18 süsinikusisaldus vahemikku 7–19%. 2.5 Poori suurus ja eripind
HPLC adsorptsioonikeskkond on poorsed osakesed ja enamik interaktsioone toimub poorides. Seetõttu peavad molekulid sisenema pooridesse, et neid adsorbeerida ja eraldada.
Poori suurus ja eripind on kaks üksteist täiendavat mõistet. Väike pooride suurus tähendab suurt eripinda ja vastupidi. Suur eripind võib suurendada proovimolekulide ja seotud faaside vahelist koostoimet, suurendada retentsiooni, suurendada proovi laadimist ja kolonni mahtuvust ning keerukate komponentide eraldamist. Täielikult poorsed täiteained kuuluvad seda tüüpi täiteainete hulka. Kõrgete eraldusnõuetega inimestel on soovitatav valida suure eripinnaga täiteained; Väike eripind võib vähendada vasturõhku, parandada kolonni efektiivsust ja vähendada tasakaaluaega, mis sobib gradientanalüüsiks. Südamikuga täiteained kuuluvad seda tüüpi täiteainete hulka. Eraldamise tagamise eelduseks on kõrgete analüüsitõhususe nõuete puhul soovitatav valida väikese eripinnaga täiteaineid. 2.6 Pooride maht ja mehaaniline tugevus
Poori maht, tuntud ka kui "pooride maht", viitab tühimiku suurusele osakese ühiku kohta. See võib hästi kajastada täiteaine mehaanilist tugevust. Suure poorimahuga täiteainete mehaaniline tugevus on veidi nõrgem kui väikese poorimahuga täiteainetel. Täiteaineid, mille pooride maht on väiksem või võrdne 1,5 ml/g, kasutatakse enamasti HPLC eraldamiseks, samas kui täiteaineid, mille pooride maht on suurem kui 1,5 ml/g, kasutatakse peamiselt molekulaarseks eksklusioonkromatograafiaks ja madalrõhukromatograafiaks. 2.7 Piiramismäär
Piiramine võib vähendada ühendite ja avatud silanoolirühmade vastastikusest mõjust põhjustatud sabapiike (nagu leeliseliste ühendite ja silanoolrühmade vaheline ioonside, van der Waalsi jõud ja vesiniksidemed happeliste ühendite ja silanoolrühmade vahel), parandades seeläbi kolonni efektiivsust ja piigi kuju. . Katmata seotud faasid tekitavad erineva selektiivsuse võrreldes kaetud seotud faasidega, eriti polaarsete proovide puhul.
- Erinevate vedelikkromatograafia kolonnide kasutusala
Selles peatükis kirjeldatakse erinevat tüüpi vedelikkromatograafia kolonnide rakendusala teatud juhtudel.
3.1 Pöördfaasi C18 kromatograafia kolonn
C18 kolonn on kõige sagedamini kasutatav pöördfaasiline kolonn, mis vastab enamiku orgaaniliste ainete sisalduse ja lisandi testidele ning on rakendatav keskmise polaarsete, nõrgalt polaarsete ja mittepolaarsete ainete puhul. C18 kromatograafilise kolonni tüüp ja spetsifikatsioon tuleks valida vastavalt konkreetsetele eraldamisnõuetele. Näiteks kõrgete eraldusnõuetega ainete puhul kasutatakse sageli spetsifikatsioone 5 μm*4,6 mm*250 mm; komplekssete eraldusmaatriksitega ja sarnase polaarsusega ainete puhul võib kasutada 4 μm*4,6 mm*250 mm spetsifikatsioone või väiksemaid osakesi. Näiteks kasutas autor tselekoksiibi API-s kahe genotoksilise lisandi tuvastamiseks 3 μm * 4,6 mm * 250 mm kolonni. Kahe aine eraldusvõime võib ulatuda 2,9-ni, mis on suurepärane. Lisaks valitakse eraldamise tagamise eeldusel, kui on vaja kiiret analüüsi, sageli lühike 10 mm või 15 mm kolonn. Näiteks kui autor kasutas piperakviinfosfaadi API genotoksilise lisandi tuvastamiseks LC-MS/MS-i, kasutati 3 μm * 2,1 mm * 100 mm kolonni. Lisandi ja põhikomponendi vaheline eraldus oli 2,0 ja proovi tuvastamine võib lõppeda 5 minutiga. 3.2 Pöördfaasiline fenüülkolonn
Fenüülkolonn on ka pöördfaasikolonni tüüp. Seda tüüpi kolonnidel on tugev selektiivsus aromaatsete ühendite suhtes. Kui tavalise C18 kolonniga mõõdetud aromaatsete ühendite reaktsioon on nõrk, võite kaaluda fenüülkolonni asendamist. Näiteks tselekoksiibi API valmistamise ajal oli sama tootja fenüülkolonni ja sama spetsifikatsiooniga mõõdetud põhikomponendi reaktsioon (kõik 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) umbes 7 korda suurem kui C18 kolonnil. 3.3 Normaalfaasi kolonn
Pöördfaasikolonni tõhusa lisandina sobib normaalfaasi kolonn väga polaarsete ühendite jaoks. Kui pöördfaasikolonnis enam kui 90% vesifaasiga elueerimisel on piik endiselt väga kiire ja isegi lahusti piigi lähedal ja sellega kattub, võite kaaluda normaalfaasi kolonni asendamist. Seda tüüpi kolonnid hõlmavad hilic kolonni, aminokolonni, tsüanokolonni jne.
3.3.1 Hilic kolonn Hilic kolonn sisaldab tavaliselt seotud alküülahelasse hüdrofiilseid rühmi, et tõhustada reaktsiooni polaarsetele ainetele. Seda tüüpi kolonnid sobivad suhkruainete analüüsimiseks. Seda tüüpi kolonni kasutas autor ksüloosi ja selle derivaatide sisalduse ja sellega seotud ainete analüüsimisel. Ksüloosi derivaadi isomeerid võivad samuti olla hästi eraldatavad;
3.3.2 Aminokolonn ja tsüanokolonn Aminokolonn ja tsüanokolonn viitavad amino- ja tsüano-modifikatsioonide sisseviimisele seotud alküülahela lõppu, et parandada selektiivsust eriainete suhtes: näiteks aminokolonn on hea valik. suhkrute, aminohapete, aluste ja amiidide eraldamiseks; tsüanokolonnil on konjugeeritud sidemete olemasolu tõttu parem selektiivsus hüdrogeenitud ja hüdrogeenimata struktuursete sarnaste ainete eraldamisel. Aminokolonni ja tsüanokolonni saab sageli vahetada tavafaasikolonni ja pöördfaasikolonni vahel, kuid sagedane ümberlülitamine pole soovitatav. 3.4 Kiraalne kolonn
Kiraalne kolonn, nagu nimigi ütleb, sobib kiraalsete ühendite eraldamiseks ja analüüsimiseks, eriti farmaatsia valdkonnas. Seda tüüpi kolonni võib kaaluda, kui tavaliste pöördfaasi- ja normaalfaasikolonnidega ei ole võimalik isomeeride eraldamist saavutada. Näiteks kasutas autor 5 μm * 4,6 mm * 250 mm kiraalset kolonni, et eraldada kaks 1,2-difenüületüleendiamiini isomeeri: (1S, 2S)-1, 2-difenüületüleendiamiin ja (1R, 2R)-1, 2 -difenüületüleendiamiin ja nende kahe vaheline eraldus ulatus ligikaudu 2,0-ni. Kiraalsed kolonnid on aga kallimad kui muud tüüpi kolonnid, tavaliselt 1W+/tk. Kui selliseid veerge on vaja, peab üksus tegema piisava eelarve. 3.5 Ioonivahetuskolonn
Ioonivahetuskolonnid sobivad laetud ioonide, nagu ioonid, valgud, nukleiinhapped ja mõned suhkruained, eraldamiseks ja analüüsimiseks. Täiteaine tüübi järgi jagunevad need katioonvahetuskolonnideks, anioonivahetuskolonnideks ja tugevate katioonivahetuskolonnideks.
Katioonvahetuskolonnid hõlmavad kaltsiumi- ja vesinikupõhiseid kolonne, mis sobivad peamiselt katioonsete ainete, näiteks aminohapete analüüsimiseks. Näiteks kasutas autor kaltsiumglükonaati ja kaltsiumatsetaati loputuslahuses analüüsides kaltsiumipõhiseid kolonne. Mõlemal ainel oli tugev reaktsioon λ=210 nm juures ja eraldusaste ulatus 3,0-ni; autor kasutas glükoosiga seotud ainete analüüsimisel vesinikupõhiseid veerge. Mitmetel peamistel sarnastel ainetel – maltoos, maltotrioos ja fruktoos – oli diferentsiaaldetektorite all kõrge tundlikkus, avastamispiir oli nii madal kui 0,5 ppm ja eraldusaste 2,0–2,5.
Anioonvahetuskolonnid sobivad peamiselt anioonsete ainete, nagu orgaanilised happed ja halogeenioonid, analüüsimiseks; tugevad katioonvahetuskolonnid on suurema ioonivahetusvõime ja selektiivsusega ning sobivad keerukate proovide eraldamiseks ja analüüsimiseks.
Ülaltoodu on vaid sissejuhatus mitmete levinud vedelikkromatograafia kolonnide tüüpide ja kasutusalade kohta koos autori enda kogemustega. Tegelikes rakendustes on ka teisi eritüüpi kromatograafilisi kolonne, nagu suurepoorilised kromatograafiakolonnid, väikesepoorilised kromatograafilised kolonnid, afiinsuskromatograafia kolonnid, mitmemoodilised kromatograafilised kolonnid, ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafia kolonnid (UHPLC), superkriitilise vedeliku kromatograafia kolonnid ( SFC) jne. Neil on erinevates valdkondades oluline roll. Konkreetne kromatograafilise kolonni tüüp tuleks valida vastavalt proovi struktuurile ja omadustele, eraldusnõuetele ja muudele eesmärkidele.
Postitusaeg: 14. juuni 2024